腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是指從腫瘤組織中分離出腫瘤細(xì)胞，在體外模擬體內(nèi)環(huán)境使其生長、增殖的技術(shù)。以下是腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的基本方法：

培養(yǎng)前準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)器材：準(zhǔn)備細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、離心管、顯微鏡、二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)等。所有器材需經(jīng)過嚴(yán)格的清洗、消毒和滅菌處理，以防止微生物污染。

培養(yǎng)基：根據(jù)腫瘤細(xì)胞的類型選擇合適的培養(yǎng)基，如 RPMI - 1640、DMEM 等。培養(yǎng)基中通常需添加 10% - 20% 的胎牛血清，以提供細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子。此外，還需加入青霉素、鏈霉素等抗生素，以防止細(xì)菌污染，其終濃度一般為青霉素 100 U/mL、鏈霉素 100 μg/mL。

消化液：常用的消化液為胰蛋白酶 - EDTA 混合液。一般胰蛋白酶的濃度為 0.25%，EDTA 的濃度為 0.02%。

細(xì)胞取材與分離

取材：在無菌條件下，從手術(shù)切除的腫瘤組織中獲取標(biāo)本。盡量選取腫瘤邊緣生長活躍的部分，避免取到壞死灶。將取下的組織放入含有預(yù)冷的、含抗生素的 PBS 緩沖液的無菌容器中，盡快送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

分離：將腫瘤組織在超凈工作臺(tái)上用 PBS 緩沖液沖洗數(shù)次，去除血液和雜質(zhì)。然后將組織剪成 1 - 2 mm3 的小塊，加入適量的消化液，在 37℃恒溫箱中消化 15 - 30 分鐘，期間輕輕搖晃容器，使組織塊與消化液充分接觸。當(dāng)組織塊變得松散，大部分細(xì)胞解離下來時(shí)，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。通過濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，去除未消化的組織塊，然后將細(xì)胞懸液離心，轉(zhuǎn)速一般為 1000 - 1500 rpm，離心 5 - 10 分鐘，棄去上清液，得到腫瘤細(xì)胞沉淀。

細(xì)胞培養(yǎng)

接種：用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞密度，一般為 1×10? - 1×10?個(gè) /mL。將細(xì)胞懸液接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，使細(xì)胞均勻分布。然后將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，在 37℃、5% CO?的條件下培養(yǎng)。

換液：培養(yǎng)過程中，細(xì)胞會(huì)消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，并產(chǎn)生代謝廢物。因此，需要定期更換培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞的生長環(huán)境。一般每隔 1 - 2 天觀察細(xì)胞生長情況并更換培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長至匯合度達(dá)到 80% - 90% 時(shí)，需要進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代

消化：吸去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用 PBS 緩沖液沖洗細(xì)胞 1 - 2 次，去除殘留的培養(yǎng)基和血清。然后加入適量的消化液，覆蓋細(xì)胞表面，在 37℃下消化 1 - 3 分鐘。當(dāng)在顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、間隙增大時(shí)，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。

吹打與接種：用移液管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來，形成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，離心，轉(zhuǎn)速和時(shí)間與初次分離細(xì)胞時(shí)相同。棄去上清液，用適量的新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后按照一定的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

凍存：當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)到一定數(shù)量時(shí)，為了長期保存細(xì)胞，需要進(jìn)行凍存。將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，離心后棄去上清液，加入適量的凍存液（一般為含 10% DMSO、20% 胎牛血清的培養(yǎng)基），使細(xì)胞密度為 1×10? - 1×10?個(gè) /mL。將細(xì)胞懸液分裝到凍存管中，密封好，然后按照一定的降溫程序進(jìn)行凍存，一般先在 4℃冰箱中放置 30 分鐘，再放入 - 20℃冰箱中放置 1 - 2 小時(shí)，最后放入 - 80℃冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)移到液氮中保存。

復(fù)蘇：從液氮中取出凍存管，迅速放入 37℃水浴鍋中，輕輕搖晃，使其在 1 - 2 分鐘內(nèi)快速解凍。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，加入適量的培養(yǎng)基，離心，棄去上清液，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種到培養(yǎng)瓶中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。